Gene Targeting

遺伝子改変マウスの作製

A.ベクターの構築から

ターゲティングベクターの構築からキメラマウス作出までの技術支援を行います。F1マウスのgenotypingの条件検討、サザン解析での確認、以後のgenotypingは、依頼者に行っていただきます。なお、サザン解析は必須です。またマウスgenotypingのサザン解析はお引き受けしておりませんので、ご了承ください。
ターゲティングベクター構築をご自身で行う場合は、「ノックアウトマウスの作製（相同組換え体の単離から）」でお申し込み下さい。

B.相同組換え体ES細胞の単離から

生体モデル開発チームの作製法（プロトコール）に従って、依頼者にベクターの作製、相同組換え体ES細胞のPCRによるスクリーニングとサザン解析を行っていただきます。生体モデル開発チームは、ES細胞の培養およびキメラマウス作出を行います。

• キメラマウスの搬出時に重要ですので、RIKEN BDRの微生物学的品質規格について、必ずご確認下さい。

• 作製開始からキメラマウス誕生まで、およそ8ヶ月間を要します（遺伝子のlocusによって左右される場合もあります）。

• 使用するES細胞は、C57BL/6N とCBAのF1ハイブリッドである【TT2】、または、C57BL/6N 由来の【HK3i (C57BL/6N)】です。

• Constructionに関しては、Conventional knockout、Conditional knockout、Knockin、Point mutationをお引き受けしていますが、遺伝子改変のストラテジーは打ち合わせによって決定致します。特殊な変異については、申し込み前にご相談ください。コンストラクションに関して双方合意した後にベクター構築を開始しますが、予期出来ず生じるトラブルについては、双方の責任で対処することご了承ください。

　

作製方法

Gene Targetingによる遺伝子改変マウスの作製は、以下の方法があります。

1）Conventional KO：ExonsをNeoにより置き換えることで欠損させる方法

loxPで挟まれたNeoを置き換えることにより、ゲノム領域をおよそ最大で3kb程度削ることができます。Neoは標的遺伝子の発現に影響することがありますので、Creマウスにより取り除き、解析することをお勧めします。

2）Conditional KO：ExonsをloxPで挟み、Creにより取り除く方法

loxPで挟むことができる領域は、1kbp程度です。それ以上になると、Neoから離れたloxPが挿入される確率が低下する傾向があります。NeoはFRTで挟まれています。Neoにより標的遺伝子の発現が影響を受けることがありますので、Flpマウスにより取り除き、解析することをお勧めします。

3）Knock-in：GFP, Creなどを挿入して発現させる方法

Neoは標的遺伝子の発現に影響することがありますので、Creマウスにより取り除き、解析することをお勧めします。

4）Point Mutation：塩基置換を挿入する方法

点変異の位置はNeoから離れると挿入される効率が低下する傾向があります。500bp程度が目安となります。Neoは標的遺伝子の発現に影響することがありますので、Creマウスにより取り除き、解析することをお勧めします。

A.ベクターの構築から

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• 1

  依頼者お申し込み
• 2

  依頼者、生体モデル開発チーム同意書締結
• 3
  依頼者、生体モデル開発チームデザイン

  cDNA情報を、変異マウス作製管理システム(以下；CDB Web)のdetailに登録してください。CDB Web上のメッセージ機能を使用し、コンストラクションについてディスカッションを行います。

  コンストラクションに応じて、必要なマウス（loxP/Neo/loxPを使った場合はCreマウス、FRT/Neo/FRTを使ったconditional KOマウスはFlpマウスなど）を、事前に入手していただく必要があります。

  例1：ユビキタスにCreを発現するマウス：EIIaCre (https://www.jax.org/strain/003724)
  例2：ユビキタスにFpplaseを発現するマウス：ACT FLPe (https://www.jax.org/strain/003800)
  *これらのトランスジェニックマウスは♀をご使用下さい。

• 4

  生体モデル開発チームベクター構築
• 5
  依頼者、生体モデル開発チームデザイン

  ターゲティングベクターが完成すると、相同組み換え体ES細胞のスクリーニングを行います（PCR、その後サザン解析を実施）。
  1回目のスクリーニングはlong PCRを用いて、96~192個のNeo耐性コロニーに対して行います。2回目のスクリーニングはlong PCRポジティブES細胞について、サザン解析を行います。

  ES細胞は、TT2(CBAxC57BL/6)とHK3i(C57BL/6)の2種類から選択できます。

  TT2
  A novel ES cell line, TT2, with high germline-differentiating potency. Yagi T., Tokunaga T., Furuta, Y., Nada S., Yoshida M., Tsukada T., Saga Y., Takeda N., Ikawa Y. and Aizawa S. Anal Biochem. 1993 Oct;214(1):70-6

  HK3i
  Three Inhibitors of FGF Receptor, ERK and GSK3 Establishes Germline-Competent Embryonic Stem Cells of C57BL/6N Mouse Strain with High Efficiency and Stability. Kiyonari H, Kaneko M, Abe S and Aizawa S. Genesis. 2010 May;48(5):317-27

• 6
  生体モデル開発チームキメラ作出・誕生

  相同組み換え体ES細胞を8細胞期胚へinjectionして、キメラマウスを作出します。
  キメラマウスの寄与率は、毛色により判別することができます。
  TT2 ES細胞を用いた場合は、70%~100%近く寄与します。毛色については「 TT2 細胞とマウスの毛色の関係（PDF）」をご参照ください。
  HK3iを用いた場合は、ほぼ100%黒毛のマウスが得られることがあります。

• 7
  生体モデル開発チームキメラマウスの送付

  RIKEN BDRの微生物学的品質規格について、必ずご確認下さい。

  キメラマウスを送付する時期に、genotyping PCRのポジティブコントロールとして
  Targeting Vectorとサザン解析プローブの鋳型、ゲノム配列などが示してある資料を送付致します。 それをもとにgenotyping PCRの条件を決定し、F1マウスのgenotypingを行って下さい。 詳しくは「条件検討のプロトコールについて（PDF）」をご覧ください。
  Conditional KOの場合はloxP配列が挿入されていないことがありますので、loxP配列の挿入が確認できるGenotyping PCRも行ってください。 詳しくは「PCRについて（PDF）」をご覧ください。
  キメラマウス引き渡し通知から実際のキメラマウス搬送までは、１ヶ月以内とします。

  生体モデル開発チームからのマウス搬出に際し、搬入先の『承認済み遺伝子組み換え実験計画書の写し（通知書及び実験計画書）』をご提出いただく必要があります。PDFをメールでお送りいただくか、FAX（078-306-3337）して下さい。
  上記に該当する書類がない場合、および生体モデル開発チームが提出すべき書類がある場合は、お早めにご連絡ください。
  運搬費用は作製費用には含まれておりませんので、ご注意下さい。

• 8
  依頼者F1マウス樹立

  キメラマウスを野生型C57BL/6 (若しくはCBA)と交配し、得られたF1マウスに対して、速やかにgenotypingを行い、データを生体モデル開発チームにご提出ください。

  Gene Targetingで作製した場合、サザン解析はPCRの正確性を確認するためのものであり、一度確認できれば以後はPCRで構いません。

• 9
  依頼者系統保存用マウスの提供

  樹立したラインは生体モデル開発チームで系統保存しますので、1ラインあたりオス2～3匹(12～40週齢)を、系統保存用マウスとして生体モデル開発チームにご提供下さい。
  凍結保存用のマウスが用意でき次第、CDB Webの掲示板（またはmutant.bdr(at)riken.jp）にご連絡下さい。

• 10
  依頼者論文発表

  第一報の論文発表に関し、論文投稿前に必ずご連絡下さい。生体モデル開発チームから共著者として加えて頂く者をご連絡いたします。
  また、Materials and Methods には、指定URLとAccession No.を記載していただくことを求めます。
  Accession No. は、相同組み換えES細胞単離時にご連絡します。

• 11
  生体モデル開発チームBRCへの寄託

  凍結保存胚の一部を、理化学研究所バイオリソース研究センターへ寄託します。寄託手続きやマウス（凍結保存胚）の搬出は、生体モデル開発チームが行います。
  寄託に際しては、（1）分与に際しては甲の合意を得ること、（２）論文発表に際し当該変異マウスの由来に関し第一報を引用しAcc. No.を記載すること、（３）発表論文を甲、乙に連絡することを分与条件とします。この際、共同開発依頼者（甲）は、分与依頼者との協議により、共同研究とする、研究目的を限定する、その他の条件を指定することができますし、分与を拒否することもできます。協議が成立しましたら、生体モデル開発チーム（乙）にご連絡下さい。その条件の下での変異マウス分与をBRCに依頼します。